PENENTUAN LETHAL DOSE 50 (LD50) ASAP CAIR GRADE 2*

Hendry T. S. Saragih1 Soesanto Mangkoewidjojo2, Syarifuddin Tato3

1. Laboratorium Histologi&Embriologi, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
2. Bagian Patologi Klinik, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
3. Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta



Abstrak

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan lethal dose 50 (LD50) asap cair grade 2 pada mencit betina strain Swiss. Sebelum penentuan dosis LD50, terlebih dahulu dilakukan prapenelitian dengan berbagai tahapan dosis dengan menggunakan 2 ekor mencit pada tiap kelompok. Uji prapenelitian ini dimaksudkan untuk mendapatkan dosis dimana kedua mencit tidak mengalami kematian dan dosis yang mengakibatkan kedua mencit mengalami kematian. Sebelum dilakukan perlakuan, mencit dipuasakan makan namun tetap diberi minum selama 4 jam sebelum dan 2 jam sesudah perlakuan. Pada tahap prapenelitian 1, larutan asap cair grade 2 diberikan secara oral dengan dosis 10, 100, 1000 dan 10.000 mg/kg bb dengan menggunakan faktor (R) 10. Setelah diperoleh kisaran dosis yang berada diantara 1000 - 10.000 mg/kg bb, kemudian dilakukan tahapan prapenelitian ke-2 dengan menggunakan faktor (R) 2 yaitu pada dosis 2000, 4000 dan 8000 mg/kg bb. Berdasarkan hasil prapenelitian, dapat diketahui bahwa dosis bawah dan atas di tahapan penelitian dimulai pada dosis 6500 mg/kg bb - 9500 mg/kg bb.
Pada tahap penelitian, mencit dibagi dalam 8 kelompok dan masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor. Kelompok 1 sebagai kontrol diberi makan dan minum standar. Kelompok 2 diberi larutan asap cair grade 2 dengan dosis 6500 mg/kg bb/oral dan kelompok 3 diberi larutan asap cair grade 2 dengan dosis 7000 mg/kg bb/oral. Kelompok
4 diberi larutan Asap cair grade 2 dosis 7500 mg/kg bb/oral dan kelompok 5 diberi larutan asap cair grade 2 dosis 8000 mg/kg bb/oral. Kelompok 6 diberi larutan asap cair grade 2 dosis 8500 mg/kg bb/oral dan kelompok 7 diberi larutan asap cair grade 2 dosis 9000 mg/kg bb/oral. Kelompok 8 diberi larutan asap cair grade 2 dosis 9500 mg/kg bb/oral/hari. Data kematian ditetapkan selama 48 jam setelah perlakuan. Penentuan LD50 dilakukan dengan melihat kematian mencit pada setiap kelompok perlakuan selama 48 jam. Gejala klinis setiap individu mencit diamati, data kematian dari setiap kelompok diolah menjadi data kumulatif yang kemudian dijadikan persentase kematian. Hasil persentase kematian kemudian dihitung dengan metode Reed-Muench menggunakan interpolasi linier untuk mendapat LD50 dan standard error (SE).
Gejala klinis yang tampak pada mencit perlakuan diantaranya peningkatan aktifitas, peningkatan bernafas, mencit tampak meregangkan badan dan beristirahat di sudut kandang. Pada akhirnya mencit mulai menutup mata dan terlihat tenang. Kelompok perlakuan dengan dosis tinggi, mencit mengalami kematian setelah periode kritis (3 jam), sementara mencit pada kelompok lainnya mati pada periode antara 24 – 48 jam. Hasil LD50
± SE asap cair grade 2 dengan metode Reed-Muench diperoleh dosis 7848 ± 191,069.

Pendahuluan


Pengasapan merupakan proses pengolahan bahan makanan yang seringkali digunakan pada pengolahan daging, ikan, dan bahan makanan lainnya. Pengasapan ini berfungsi selain menurunkan kadar air juga mengembangkan warna, cita rasa yang spesifik dan menghambat mikrobia. Proses pengasapan secara tradisional dengan menggunakan asap pembakaran secara langsung mempunyai beberapa kelemahan seperti kualitas yang kurang konsisten, kesulitan pengendalian prosesnya, terdepositnya ter pada bahan makanan sehingga membahayakan kesehatan. Pengasapan juga menyebabkan pencemaran lingkungan serta memungkinkan bahaya kebakaran (Amriah, dkk., 2006).
Kelemahan-kelemahan di atas dapat diatasi dengan mengembangkan proses pengasapan menggunakan asap cair, yaitu campuran larutan dari dispersi uap asap kayu dalam air (Amriah, dkk., 2006).
Asap cair yang berasal dari tempurung kelapa dapat digunakan sebagai bahan dasar dengan cara pirolisis dalam reaktor pada suhu 400 – 500 oC diikuti dengan kondensasi menggunakan air sebagai medium pendingin. Kondensat yang dihasilkan didestilasi sebanyak dua kali dan disaring dengan zeolit diteruskan dengan penyaringan vakum (Asap Cair 1). Asap cair kedua berasal dari destilasi 2x dilanjutkan dengan destilasi fraksinasi
0 – 100 oC (Asap cair grade 2). Dari hasil penelitian asap cair yang jernih kekuningan atau asap cair grade 2 bagus digunakan untuk pengawetan makanan seperti bakso, tahu dan mie (Amriah, dkk., 2006).
Penggunaan asap cair untuk memberikan citarasa serta pengawetan ada beberapa metode seperti penambahan asap cair langsung ke produk dalam bentuk saus, pencelupan langsung dalam asap cair, penyemprotan larutan asap ke produk, atomisasi asap cair dalam bentuk kabut, dan penguapan asap cair sehingga berubah bentuk manjadi asap sehingga kontak dengan produk (Amriah, dkk., 2006).
Namun demikian, pengujian sifat toksik dari asap cair grade 2 belum dilakukan baik menggunakan hewan model ikan ataupun mamalia. Pengujian daya toksik suatu bahan kimia dapat dilakukan dengan penentuan lethal concentration 50 (LC50) pada ikan atau pengujian lethal dose 50 (LD50) pada hewan mamalia seperti kelinci, tikus dan mencit. Penetapan LD50 adalah penetapan kemampuan toksik suatu bahan kimia secara akut yang menyebabkan kematian hewan coba hingga mencapai 50% melalui pemberian secara oral

(Anonim, 1998).
Uji toksisitas akut sangat penting untuk mengukur dan mengevaluasi karakteristik toksik dari suatu bahan kimia. Uji ini dapat menyediakan informasi tentang bahaya kesehatan manusia yang berasal dari bahan kimia yang terpapar dalam tubuh pada waktu pendek melalui jalur oral. Data uji akut juga dapat menjadi dasar klasifikasi dan pelabelan suatu bahan kimia (Anonim, 1998).
Toksisitas akut didefinisikan sebagai kejadian keracunan akibat pamaparan bahan toksik dalam waktu singkat, yang biasanya dihitung menggunakan nilai LC50 atau LD50. Nilai ini didapatkan melalui proses statistik dan berfungsi mengukur angka relatif toksisitas akut bahan kimia (Anonim, 1998). Toksisitas akut dari bahan kimia lingkungan dapat ditetapkan secara eksperimen menggunakan spesies tertentu seperti mamalia, bangsa unggas, ikan, hewan invertebrata, tumbuhan vaskuler dan alga (Hodgson dan Levi, 1997). Uji toksisitas akut dapat menggunakan beberapa hewan mamalia, namun yang dianjurkan untuk uji LD50 diantaranya tikus, mencit dan kelinci (Anonim, 1998).
Uji toksisitas akut dapat dipengaruhi oleh respon biologik hewan uji seperti jenis kelamin. Contoh respon tubuh akibat jenis kelamin yaitu nilai LD50 Digitoxin yang diuji pada tikus jantan diperoleh angka 56 mg/kg bb, sementara untuk tikus betina 94 mg/kg bb
(Buck, dkk.,1976). Pada uji toksisitas, disyaratkan untuk setiap kelompok perlakuan menggunakan hewan coba dengan jenis kelamin sejenis dan umur yang direkomendasikan seperti untuk tikus dan mencit, umur yang direkomendasikan untuk uji adalah diantara

8 – 12 minggu, sementara untuk kelinci berumur 12 minggu (Anonim, 1998).
Penelitian ini dilakukan untuk menguji LD50 bahan asap cair grade 2 menggunakan hewan model mencit betina galur Swiss.



Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan lethal dose 50 (LD50) asap cair grade 2
pada mencit betina galur Swiss.Materi dan Metode



Asap cair grade 2
Larutan asap cair pekat digunakan sebagai bahan awal penelitian yang kemudian diencerkan menjadi konsentrasi 60% dan 6%. Perhitungan dosis LD50 yang menggunakan satuan mg/kg bb, pada larutan asap cair ini dihitung berdasar pengenceran konsentrasi 60% dan 6%. Perlakuan diberikan secara oral pada mencit dengan volume 0,5 ml/30 gr bb. Selama perlakuan, peneliti menggunakan hand spoon disposible dan masker.



Hewan coba
Sembilan puluh empat ekor mencit galur Swiss, jenis kelamin betina, belum beranak dan tidak bunting, umur 2 bulan dengan berat rata-rata 30 gram digunakan untuk penelitian ini. Mencit diperoleh dari Unit Pelayanan Pra Klinik LPPT UGM. Mencit dikandangkan menggunakan fasilitas kandang Unit Pelayanan Pra Klinik LPPT Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dengan suhu 27±10C dan kelembaban 65±5%. Mencit sebelum diberi perlakuan, diadaptasikan dahulu terhadap kondisi penelitian selama

1 minggu (Anonim, 1998). Mencit diberi makanan standar berbentuk pelet jenis BR-1

(Comfeed Indonesia) serta air minum secara ad libitum.



Rancangan percobaan LD50
Berdasarkan metode Weil (1952), untuk menentukan dosis LD50, terlebih dahulu dilakukan prapenelitian dengan berbagai tahapan dosis menggunakan 2 ekor mencit pada tiap kelompok (Al-Sultan dan Hussein, 2006). Uji prapenelitian ini dimaksudkan untuk mendapatkan dosis dimana kedua mencit tidak mengalami kematian, dan dosis yang mengakibatkan kedua mencit mengalami kematian (Miya, dkk., 1976). Sebelum dilakukan perlakuan, mencit dipuasakan makan namun tetap diberi minum selama 4 jam sebelum dan
2 jam sesudah perlakuan (Anonim, 1998). Tahap prapenelitian pertama, larutan asap cair grade 2 diberikan secara oral dengan dosis 10, 100, 1000 dan 10.000 mg/kg bb dengan menggunakan faktor (R) 10. Setelah diperoleh kisaran dosis berada diantara 1000 - 10.000 mg/kg bb, kemudian dilakukan tahapan prapenelitian 2 dengan menggunakan faktor (R) 2 yaitu pada dosis 2000, 4000 dan 8000 mg/kg bb (Buck, dkk.,1976; Anonim, 1998). Berdasarkan hasil prapenelitian, dosis bawah dan atas ditemukan masing-masing 6500
mg/kg bb dan 9500 mg/kg bb, sehingga dosis tersebut digunakan sebagai pedoman pada tahap penelitian.
Pada tahap penelitian, digunakan 80 ekor mencit. Mencit dibagi dalam 8 kelompok dan masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor. Mencit kelompok 1 sebagai kontrol diberi makan dan minum standar. Kelompok 2 diberi larutan asap cair dengan dosis 6500 mg/kg bb/oral dan kelompok 3 diberi larutan asap cair dengan dosis 7000 mg/kg bb/oral. Kelompok 4 diberi larutan asap cair dosis 7500 mg/kg bb/oral dan kelompok 5 diberi larutan asap cair dosis 8000 mg/kg bb/oral. Kelompok 6 diberi larutan asap cair dosis 8500 mg/kg bb/oral dan kelompok 7 diberi larutan asap cair dosis 9000 mg/kg bb/oral. Kelompok 8 diberi larutan asap cair dosis 9500 mg/kg bb/oral/hari. Data kematian ditetapkan selama 48 jam setelah perlakuan (Anonim, 1998).



Penentuan LD50
Penentuan LD50 dilakukan dengan melihat kematian mencit pada setiap kelompok perlakuan mulai dosis 6500-9500 mg/kg bb selama 48 jam. Data kematian dari setiap kelompok diolah menjadi data kumulatif yang kemudian dijadikan persentase kematian. Hasil persentase kematian kemudian diolah menurut metode Reed-Muench dengan interpolasi linier untuk mendapat LD50 dan standard error (SE) (Miya, dkk., 1976).





Gejala klinis


Hasil dan Pembahasan


Gejala klinis yang tampak pada mencit perlakuan dosis tinggi diantaranya peningkatan aktifitas, peningkatan bernafas, mencit tampak meregangkan badan dan beristirahat di sudut kandang. Pada akhirnya mencit mulai menutup mata dan terlihat tenang. Kelompok perlakuan dengan dosis tinggi, mencit mengalami kematian setelah periode kritis (3 jam), sementara mencit pada kelompok lainnya mati pada periode antara 24 – 48 jam.

Penetapan LD50 dan standard error (SE)
Penetapan LD50 menurut metode Reed-Muench menggunakan interpolasi linier dapat dilihat pada tabel 1.
Penelitian atau kajian literatur yang menjelaskan tentang toksisitas asap cair grade 2 yang berasal dari tempurung kelapa pada mencit belum pernah dilakukan. Penelitian ini dimaksudkan untuk menentukan dosis LD50 asap cair grade 2 yang berasal dari tempurung kelapa. Gejala klinis yang umum pada kejadian hewan yang mengalami toksik yang berat diantaranya salifasi yang berlebih, diare, peradangan pada mulut, esofagus, dan lambung, reaksi pupil mata yang menurun, takikardia, hewan tidak mau bergerak atau bergerak tidak teratur (Al-Sultan dan Hussein, 2006). Gejala klinis mencit kelompok perlakuan dosis
9000-9500 mg/kg bb pada penelitian ini meliputi gejala peningkatan aktifitas, peningkatan bernafas, mencit tampak meregangkan badan dan beristirahat di sudut kandang. Pada akhirnya mencit mulai menutup mata dan terlihat tenang. Gejala klinis mencit kelompok dosis 6500 – 8000 mg/kg bb tidak menunjukkan gejala toksik yang berat. Waktu kematian pada perlakuan dosis 9000 – 9500 rata-rata 17 jam, waktu kematian pada dosis

8000 – 8500 rata-rata 24 jam, sementara waktu kematian pada dosis 7000 – 7500 rata-rata
36 jam. Data waktu kematian ini, menunjukkan bahwa pada dosis 9000 – 9500 merupakan dosis toksisitas tinggi.

Hasil LD50 ± SE asap cair grade 2 yang telah di uji dengan metode Reed-Muench
(Miya, dkk., 1976) yaitu 7848 ± 191,069 mg/kg bb. Menurut Hodgson dan Levi (1997), skema rangking nilai toksisitas akut (LD50) bahan kimia yang diuji pada hewan mamalia, untuk dosis LD50 dosis kurang dari 50 mg/kg bb dinyatakan bersifat toksik yang ekstrim, dosis 50 – 500 mg/kg bb dinyatakan sangat toksik, dosis 500 – 5000 mg/kg bb dinyatakan bersifat toksik moderat, sementara dosis diatas 5000 mg/kg bb dinyatakan relatif tidak toksik. Dari hasil penelitian LD50 yang telah dilakukan diperoleh nilai LD50 yaitu
7848 ± 191,069 mg/kg bb. Berdasarkan skema rangking nilai toksisitas akut (lihat tabel 2.), dinyatakan bahwa larutan asap cair grade 2 relatif tidak toksik.



Ucapan Terimakasih



Ucapan terima kasih diucapkan kepada Direktur CV. Pusat Pengolahan Kelapa

Terpadu, Yogyakarta yang telah membantu dalam pengadaan Asap Cair Grade 2.

*Prosiding Seminar Nasional ”Peran Bioteknologi bagi Kesejahteraan Umat”, Yogyakarta, 24 Mei 2008. Diselenggarakan oleh Yayasan Memajukan Bioteknologi Indonesia bekerjasama dengan LPPOM MUI-DIY